DNA鉴定-三种DNA提取方法

来源：北京亲子鉴定中心

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（一）QIAGEN法

采用QIAGEN公司的QIAamp@ DNA mini and blood mini提取试剂盒，经过蛋白酶K消化、硅膜过滤、洗涤杂质与DNA洗脱几个步骤后可以得到纯度较高的DNA。具体操作步曩蟹下瞬述：

1)在脱蜡后的待检样本中加入180µl Buffer ATL，另加20µl蛋白酶K，摇匀置56℃中孵育消化直至组织完全消化，液体呈清亮为止。

2)加200µl AL缓冲液置70℃裂解10min。

3)加200µl乙醇(96％～100％)振荡混匀。

4)在离心机上稍作离心后，将全部液体小心转移到硅膜层析柱上，以6000g (8000r/ min)离心2min，弃收集液。

5)将硅膜层析柱移至另一干净收集管上，小心加入500µl AW1缓冲液，以6000g (8000r/min)离心2min，弃收集液。

6)将硅膜层析柱移至另一干净收集管上，小心加入500µl AW2缓冲液，以6000g (8000r／min)离心2min，弃收集液。

7)再以20 000g (14 000rlmin)离心3min以使硅膜完全干透。

8)将硅膜层析柱移至一普通离心管(1. 5ml)上，加20～100µl TE缓冲液将结合在硅膜上的DNA洗脱。甲醛固定组织的洗脱液体积为200yl，2片石蜡包埋组织的洗脱液体积为100µl，H.E染色切片组织的洗脱液体积为50µl。

9)在室温(15～25℃)条件下静置约1min，以20 000g (14 000r/min)离心1min，收集DNA洗脱液。

（二）IQ法

采用Promega公司的Tissue and Hair Extraction Kit (for use with DNA IQTM)提取试剂盒，经过蛋白酶K消化、磁化树脂结合（磁化架）、洗涤纯化（lysis buffer，3次）和DNA洗脱(Elution buffer 100µl，65℃）四个步骤可完成DNA提取，操作过程如下所述。

1)在脱蜡后的待检样本中加入200µl含有蛋白酶K(1.8mg/ml)和DTT (0. Imol／L)的孵育缓冲液(IB)，摇匀，置于56℃中孵育消化，直至组织完全消化，液体呈清亮为止。

2)加400µl消化缓冲液(lysis buffer)。

3)加14µl树脂(Resin)，振荡混匀，置于室温5min后再振荡2s立即放置在磁化架上结合，移除多余液体。

4)再加100µl含有DTT (0.01mol／L)的消化缓冲液(lysis buffer)，振荡2s立即放置在磁化架上结合进行洗涤纯化。重复3次。

5)在磁化架上将树脂(Resin)嘹干5min，加20～100ul洗脱缓冲液(EB)振荡后置65℃5min，然后振荡2s后立即放置在磁化架上，收集液体DVA。

（三）Chelex-100法

1） 56℃消化(200µl 5%Chelex，40µl 10mg/µl蛋白酶K，8µl 1mol／L DTT) 至溶液清澈。

2）剧烈震荡5 5～10s。

3）沸水煮8min。

4）剧烈振荡5～10s； 14000r/min离心5min；取上清液用于扩增反应。

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